荧光定量PCR防污染注意事项
浏览次数：515次 发布时间：2021-11-05
由于荧光定量PCR极其灵敏， 微量的污染就可能造成扩增体系的失败， 而且污染极难去除， 因此在荧光定量PCR操作中应时刻避免可能的污染，操作要点如下：
1.分区操作, 配体系和加阳性标准品和疑似样品核酸与PCR扩增需在不同实验室空间进行。
2.试剂专用，并以小份储存。配制溶液时，应使用没有接触过本实验室使用的DNA的新玻璃、塑料器皿和吸头。溶液使用过后即丢弃。
3.普通PCR要避免在上述区域内操作，尤其是电泳环节等可能造成大量DNA外溢的操作。PCR扩增后，体系禁止开盖，PCR扩增样品禁止带回实验操作区。
4. 实验时着一次性外科手术防护服，口罩， 帽子， 带手套， 定期更换。
5.一切实验操作使用专用移液器和带滤芯的枪头。
6.用于加样和配体系的加样器要分开。
7.如果使用超净台加阳性模板时不要开风机。
8.一些可能做成污染的危险操作，如阳性标准品的制备、包含有目标模板的阳性标 准品的克隆、电泳等操作、配制稀释阳性标准品、阳性对照模板的制备都应事先在 其他实验室操作完成， 上述实验操作使用的装备在荧光大量PCR操作中也要避免。
9.配体系时，0.2ml排管和PCR管操作建议放置在干净的枪头盒（应在冰上）操作。
10.试验过程中注意用洁净的管盖及时盖住加入模板或阳性品的反应管，在大量试验 和用96孔板加样实验时尤其要注意。
11.使用专用的微量离心机。
12.打开装有反应物的离心管之前，先在离心机上短暂离心10秒钟，使液体沉积至管 底，减少污染手套和移液器的可能性。
13.不同样品操作之间，怀疑有可能污染的环节要更换手套，（如冰箱内取试剂、搬移物件）。
14. 试剂配制专用去RNA酶的水，实验样品和试剂要专属放置特定冰箱层。
15.模板加样顺序为， 阴性对照， 疑似样品， 阳性对照。
16.实验结束后， 桌面水与84一比十比例擦拭，紫外260 nm灯照射2h， 实验废料及时清除。
注普通PCR的操作虽说防污染没有荧光定量一样严格，也应遵循上述操作要点的关键原则。
